应用案例

应用简介：

本研究利用His标签蛋白纯化磁珠，纯化带有His6- MBP标签的Cas1、Cas2、Cas4 三个蛋白，结合MBP Pull-down分析，揭示Cas1、Cas2、Cas4 三个蛋白间的互作关系。

文献解析：

2021年2月22日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室陈强教授团队，在Nucleic Acids Research（IF=11.501）在线发表了标题为“Mechanisms of spacer acquisition by sequential assembly of the adaptation module in Synechocystis”的研究成果。该团队研究人员通过利用His标签蛋白纯化磁珠（BeaverBeads^® IDA-Nickel cat. 70501），纯化带有His 6-MBP标签的Cas1、Cas2、Cas4 三个蛋白，结合MBP Pull-down（图1）分析及其他生物化学实验，揭示了Cas1、Cas2、Cas4 三个蛋白间的互作关系，并且解析了Cas1-Cas2-Spacer三元复合物的晶体结构（图2）和Cas1-Cas4二元复合物的电镜负染结构（图3），阐明了Cas4参与外源DNA捕获与整合的新机制。

图1.MBP pull-down 分析

图2.Cas1-Cas2-Spacer三元复合物结构

图3.Cas1-Cas4二元复合物结构

该团队认为，在I-D 型系统中， Cas4和Cas2会竞争性地与Cas1结合，可以形成 Cas1-Cas4和 Cas1-Cas2-Spacer 两种复合物，这两种复合物按次序先后参与间隔序列的整合。I-D型系统的间隔序列整合分为两个步骤：1）间隔序列的加工；2）间隔序列的整合。在此过程中，Cas1-Cas4复合物通过Cas4的PAM序列特异性的内切酶活性对间隔序列进行识别和加工，加工成熟的间隔序列又与Cas1、Cas2形成比Cas1-Cas4复合物更加稳定的Cas1-Cas2-Spacer复合物，将间隔序列插入到CRISPR位点，完成间隔序列的整合。

CRISPR-Cas基因编辑技术已经广泛应用于全球实验室，对CRISPR-Cas系统更加深入的了解不仅拓宽了人类的知识边界，还有助于开发更新一代的基因编辑工具。（部分内容来源于网络）

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